Cientistas do Japão usaram a tecnologia CRISPR-Cas9 para impedir a replicação do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) em células T latentemente infectadas que não podem ser controladas usando os tratamentos com medicamentos existentes. A abordagem de edição de genes efetivamente perturba dois genes reguladores do HIV-1, tat e rev , que são essenciais para a replicação viral. Descrevendo seus estudos in vitro em Scientific Reports , os pesquisadores da Escola de Medicina da Universidade de Kobe e da Escola de Ciências da Saúde da Universidade de Kobe dizem que os resultados iniciais indicam que o uso de CRISPR-Cas9 para direcionar genes reguladores do HIV-1 pode oferecer uma nova abordagem. curas funcionais ”.
"Estes resultados mostram que o sistema CRISPR-Cas9, visando os genes reguladores do HIV-1, tat e rev , é um método promissor para tratar a infecção pelo HIV", comenta o co-autor Masanori Kameoka, Ph.D., professor associado. na Escola de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade de Kobe. "Agora precisamos investigar como podemos seletivamente introduzir um sistema CRISPR-Cas9 que atinja genes do HIV-1 nas células infectadas de pacientes."
O artigo publicado pela equipe, em co-autoria do Dr. Kameoka, e os pesquisadores Youdiil Ophinni, Mari Inoue, Ph.D., e Tomohiro Kotaki, Ph.D., intitulam-se “ Sistema CRISPR / Cas9 Targeting Genes Regulatórios do HIV-1 Inibem a Replicação Viral em Culturas de Células T Infectadas ”.
O HIV-1 infecta cerca de 35 milhões de pessoas em todo o mundo e, embora a terapia antirretroviral (ART) vitalícia possa ajudar a converter uma infecção mortal em uma “doença crônica mais manejável”, os tratamentos atuais não são uma cura porque não podem erradicar completamente a doença. vírus, que insere seus genes no DNA das células do hospedeiro, explicam os autores. Apesar do tratamento usando ART, o HIV-1 continua a se replicar em um nível muito baixo em alguns tipos celulares do sistema imunológico infectados de forma latente, como células CD4 + , macrófagos e células dendríticas foliculares. "Os atuais compostos antivirais são incapazes de atacar o genoma proviral integrado dentro desses reservatórios celulares e a recuperação viral rápida ocorre após a interrupção da TAR", explicam. O vírus também pode se esconder em tecidos como o sistema nervoso central.
As células T CD4 + têm sido as mais estudadas dos reservatórios celulares nos quais o HIV-1 pode persistir. Uma pequena fração de células CD4 + em repouso abrigará o HIV-1, mesmo durante a TAR, e é considerada “o principal obstáculo à erradicação do HIV-1”, destacam os autores. “A infecção latente pelo HIV-1 nas células T CD4 + em repouso é a principal causa da barreira à cura funcional.” Eles sugerem que uma “intervenção única para limpar a persistência genômica viral representa uma abordagem sensata e promissora para alcançar uma cura funcional.
Uma abordagem potencial para erradicar o HIV-1 de tais reservatórios é interromper diretamente o genoma proviral usando ferramentas de edição do genoma. Infelizmente, tecnologias como a nuclease do dedo de zinco (ZFN) e a nuclease efectora do tipo ativador de transcrição (TALEN) mostraram-se problemáticas devido a “dificuldades associadas ao projeto, síntese e validação de proteínas para um locus genético específico de interesse”.
A equipe da Escola de Pós-Graduação da Universidade de Kobe desenvolveu uma abordagem alternativa usando a edição do gene CRISPR-Cas9 para romper dois genes virais reguladores, tat e rev, que são essenciais para a replicação viral e que também são altamente conservados em diferentes subtipos de HIV-1.
Os cientistas gerado seis ARNs de guia (gRNAs) -três segmentação tat e três segmentação Rev- para dirigir a enzima cas9 de clivagem de ADN para os sítios relevantes no DNA proviral. Eles empacotaram gRNAs e o sistema de enzima Cas9 em um vetor lentiviral, que eles poderiam então introduzir em células cultivadas.
Estudos iniciais demonstraram que o vetor efetivamente aboliu a expressão de tat e rev em células cultivadas que foram projetadas para expressar os genes. Os genes-alvo foram mutados nos locais de clivagem Cas9 com “alta frequência e várias mutações de indel [inserção / deleção]”, escrevem os autores. Encorajadoramente, a transdução de CRISPR-Cas9 de células T humanas não teve efeito na viabilidade celular, e não houve mutações detectáveis fora do alvo no ADN humano.
As construções CRISPR também direcionaram a expressão de tat e rev em células T CD4 + infectadas de forma latente , “provando que a entrega lentiviral do sistema CRISPR / Cas9 alcançou e clivou com sucesso o genoma proviral dormente do HIV-1”, afirmam. As construções também suprimiram marcadamente a reativação do HIV-1 dependente de citocinas em células infectadas de forma latente e inibiram a replicação viral em células persistentemente infectadas. A equipe diz que esses resultados "demonstraram que a entrega lentiviral de CRISPR / Cas9 alcançou com sucesso o genoma proviral isolado, genes reguladores clivados e inibiu significativamente a replicação viral, mesmo após a reversão da latência".
Eles alegam que a capacidade de transduzir células não-divididas, como células T CD4 + em repouso , usando construções lentivirais e alcançar a expressão do transgene Cas9 a longo prazo, apóia a viabilidade de usar o sistema para erradicar células que agem como reservatórios latentes do HIV-1.
Eles reconhecem que mais pesquisas serão necessárias para traduzir seu trabalho in vitro em modelos pré-clínicos in vivo e pacientes humanos. “Para introduzir com segurança e eficácia o sistema CRISPR-Cas9, os vetores devem ser melhorados”, observa o Dr. Kameoka. "Esperamos que esta pesquisa nos forneça informações úteis no desenvolvimento de um método de tratamento que possa curar completamente a infecção pelo HIV-1."
“A capacidade dos vetores lentivirais de transduzir células não divididas, incluindo células T CD4 + emrepouso , e manter a expressão do transgene Cas9 estável a longo prazo, sustenta seu uso potencial na erradicação de células infectadas que constituem o reservatório latente”, concluem os pesquisadores. "Com base nos rápidos avanços que estão sendo alcançados na pesquisa CRISPR / Cas9, uma cura funcional do HIV-1 pode em breve estar ao nosso alcance."
https://www.genengnews.com/gen-news-highlights/crispr-eradicates-latent-hiv-1-offering-hope-of-functional-cures/81255839
CB
