http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(17)31386-4
Destaques
- •FLIPS utiliza NGS para seqüenciar e caracterizar geneticamente os provírus do HIV-1
- •O FLIPS identifica provírus HIV-1 genéticamente intactos e com probabilidade de replicação
- •Providentes idênticos do HIV-1 sugerem manutenção do reservatório pela proliferação celular
- •Demonstrar as vantagens de FLIPS em relação a outros ensaios comuns de seqüência de HIV-1
Resumo
O HIV-1 competente para a replicação latente persiste em indivíduos com terapia antirretroviral de longa duração (ART). Desenvolvemos o ensaio de sequenciação de provadores individuais completos (FLIPS) para determinar a distribuição de HIV-1 com capacidade de replicação latente nas células de memória CD4 +Subconjuntos de células T em seis indivíduos em ART de longo prazo. O FLIPS é um ensaio eficiente e de alto rendimento que amplifica e seqüência mais perto de genomas proviral HIV-1 de comprimento total (~ 9 kb) e determina a potencial competência de replicação através da caracterização genética. O FLIPS fornece uma perspectiva de escala do genoma que aborda as limitações de outros métodos que também caracterizam geneticamente o reservatório latente. Usando FLIPS, identificamos 5% dos provírus como intactos e potencialmente replicáveis. Os provírus intactos foram distribuídos de forma desigual entre subconjuntos de células T, com células de memória efectoras contendo a maior proporção de provírus HIV-1 geneticamente intactos. Identificamos múltiplos provírus intactos idênticos, sugerindo um papel para a proliferação celular na manutenção do reservatório latente HIV-1.
FLIPS
Ao realizar o ensaio FLIPS, o NGS é usado para seqüenciar provérbios HIV-1 únicos (intactos e defeituosos). Duas rodadas de PCR aninhada em diluição limitante usando iniciadores que visam as regiões de repetição terminal longa (LTR) de 5 'e 3' U5 altamente conservadas são usadas para amplificar ~ 9 kb do genoma do HIV-1 ( Figura 1 A). O NGS de provadores amplificados de alto rendimento é realizado na plataforma Illumina MiSeq, e os contigs províricos individuais são gerados pela montagem de novo . Para identificar provérbios defeituosos, é utilizado um rigoroso processo de eliminação ( Figura 1B) pelo qual os provírus que contêm sequências de inversão, deleções internas grandes (> 100 pb), hipermutação / codões de parada detestáveis, quadros de quadros ou mutações no sinal de empacotamento ou no principal dador de amoldos (MSD) são definidos como defeituosos e replicativos incompetentes. Os provadores que faltam esses defeitos são considerados geneticamente intactos e potencialmente replicáveis. Na otimização do ensaio FLIPS, primeiro determinamos a extensão em que o FLIPS amplifica o DNA do HIV-1 presente em uma amostra. Para isso, diluímos o plasmídeo HIV-1 pWT / BaL (obtido através do Programa de Reagentes de AIDS, Divisão de AIDS, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas [NIAID], NIH: HIV-1 HXB3 / BaL Clone Molecular Infeccioso (pWT / BaL) do Dr. Bryan R. Cullen) de 20 cópias para uma cópia e realizaram múltiplas reações de PCR de comprimento total em cada diluição,Figura 1 E). O número de reações positivas diminuiu com o número de modelos por reação, com FLIPS amplificando 5% das reações quando pWT / BaL foi diluído para 1 e 2 cópias por reação. Ao calcular a distribuição de Poisson para esta experiência, o número esperado de modelos amplificados por reação correspondeu ao número real de cópias por reação, sustentando que, em diluições de 1 e 2 cópias por poço, os produtos amplificados são originários de um único modelo.
A classificação de um provírus sequenciado como intacta depende da ausência de deleções, inserções e / ou mutações. Em seguida, era importante determinar a taxa de erro do ensaio FLIPS, uma vez que os erros da polimerase poderiam introduzir artificialmente defeitos no contig proviral final. Amplificamos o plasmídeo pWT / BaL intacto na diluição limitante e 10 amplicões sequenciados que comparamos à sequência de referência pWT / BaL disponível. Nenhuma das seqüências continha eliminações ou inserções; No entanto, uma seqüência continha uma única mudança de nucleotídeo (C | T) na posição 1519 (em relação a HXB2). Isso permitiu a determinação da taxa de erro para o teste FLIPS como 1 mudança em cada 89.330 nt seqüenciado (ou 1.12 × 10 -5 nt -1 ) (intervalo de confiança, 1 em 16.000 para 1 em 3.530.000).
Os provírus competentes de replicação persistem em estado latente em indivíduos em ART supressiva e a carga viral rapidamente se recupera após a cessação da terapia ( Chun et al., 2010 , Davey et al., 1999 ). Estudos anteriores identificaram o HIV-1 competente para a replicação latente em vários subconjuntos de células T CD4 + incluindo memória ingênua (T N ), central (T CM ), transicional (T TM ) e efetora (T EM ) ( Chomont et al ., 2009 , Soriano-Sarabia et al., 2014). Para determinar se a distribuição de vírus HIV-1 com potencial de replicação diferentes foi diferente entre os subconjuntos de células, aplicamos o ensaio FLIPS para caracterizar geneticamente o reservatório latente de HIV-1 em diferentes subconjuntos de células T CD4 + isolados do sangue periférico dos participantes em longo - ARTE supressiva. Obtivemos subconjuntos de células T T N , T CM , T TM e T EM CD4 + de seis participantes que estavam em TAR supressiva por 3 a 17 anos (3 ART iniciada durante infecção aguda / precoce (2115, 2275 e 2302) e 3 iniciaram TAR durante infecção crônica (2026, 2046, 2452)
...
Continua em:
http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(17)31386-4
CB
Nenhum comentário:
Postar um comentário