'Tesoura molecular' remove com sucesso genes do HIV de todos os tecidos em macacos infectados

Gus Cairns

Publicado em: 08 março 2019

A principal matéria da Conferência sobre Retrovírus e Infecções Oportunistas (CROI 2019), em Seattle, esta semana, tem sido uma provável segunda cura para o HIV . No entanto, a cura envolveu uma terapia cara e arriscada - um transplante de medula óssea - que nunca seria amplamente aplicável.

Tão significativo a longo prazo pode ser um estudo relatado na mesma sessão que usou uma tecnologia muito mais benigna para alcançar o que pode ser uma cura em macacos.

Uma equipe de pesquisadores da Temple University, na Filadélfia, EUA, removeu os genes retrovirais das células de macacos infectados com SIV, o análogo de macaco do HIV. Os pesquisadores descobriram que a enzima que eles usavam, contida dentro da casca de um vírus comum, para simular uma infecção e entrar nas células, removeu com sucesso os genes SIV de uma maioria - e possivelmente todas - de todas as células. os órgãos dos macacos onde os níveis foram medidos, incluindo os de difícil acesso, como o cérebro.

Como os macacos neste experimento foram sacrificados após a intervenção para que todos os tecidos pudessem ser biopsiados, não podemos dizer se o que os pesquisadores conseguiram é uma cura para o SIV. Mas a natureza abrangente dos resultados é impressionante, e qualquer tentativa de cultivar SIV a partir das células imunes no sangue dos macacos tratados, no que é chamado de ensaio de crescimento viral, não produziu nenhum vírus. O próximo passo será dar a mesma terapia aos macacos positivos para SIV em terapia anti-retroviral (ART) e então interromper o tratamento para descobrir se o SIV reaparece.

O experimento

A tecnologia de splicing de genes foi originalmente aplicada ao SIV em estudos relatados em 2016pela mesma equipe de pesquisa. Os componentes ativos no vetor viral (casca) são duplos. Em primeiro lugar, o vetor contém comprimentos de RNA guia (gRNA), cujo trabalho é encontrar as sequências de SIV dentro do genoma dos macacos - ele pode detectar e se ligar a seqüências específicas em SIV que são altamente conservadas, ou seja, não mudam muito de um variedade de SIV para outro. Em segundo lugar, também contém uma enzima chamada CRISPR / Cas9 que “corta” o material genético do SIV e reencontra as extremidades cortadas, substituindo a sequência longa de SIV por uma sequência genética curta que serve como um sinal de que a excisão do gene ocorreu.

Novos estudos em 2016 descobriram que o DNA do SIV logo desenvolveu mutações que levaram à resistência - descobriu uma maneira de se tornar "invisível" ao gRNA. Comentamos na época que o Cas9 degradador de genes precisaria ser anexado a uma variedade de gRNAs diferentes para evitar isso, e isso é o que foi feito no novo estudo. Os gRNAs permitiram a excisão de três seções diferentes do SIV, permitindo uma probabilidade muito baixa do desenvolvimento de mutantes de escape. Duas das edições genéticas envolveram a remoção de quase todo o genoma do SIV; o terceiro envolveu a remoção de um comprimento mais curto, mas ainda significativo, de cerca de 10% do genoma viral e sua substituição por uma sequência projetada para ser uma “bandeira” indicando que a excisão bem-sucedida havia ocorrido.

Apenas três macacos foram usados ​​no experimento. Todos foram infectados com SIV e, em seguida, doze semanas após a infecção foram colocados em TAR. Oito semanas depois, as células imunológicas foram retiradas do sangue e a terapia com gRNA / Cas9 foi realizada em experimentos em laboratório. Estes produziram resultados positivos, com o 'produto de excisão' (o pequeno comprimento do DNA 'bandeira' que substituiu o comprimento excisado) sendo prontamente detectável, assim como outros marcadores genéticos que indicaram excisão bem sucedida.

Quatro semanas depois, a terapia com gRNA / Cas9 foi dada a dois dos três macacos, com o terceiro recebendo nenhuma terapia e servindo como controle. A terapia foi administrada como uma infusão durante 100 minutos e no total cerca de 100 biliões de partículas de adenovírus contendo a terapia foram transfundidas.

Três semanas depois, os macacos que receberam a terapia foram eutanasiados e muitos tecidos corporais diferentes foram amostrados para verificar se o DNA do SIV havia sido retirado das células infectadas. Os linfócitos retirados do sangue também foram cultivados no laboratório para ver se o vírus poderia ser cultivado a partir deles. O mesmo ensaio de crescimento viral e amostragem de tecido foi também realizado no macaco de controlo.

Resultados

As células do macaco de controlo produziram prontamente vírus no laboratório, mas nenhum foi produzido pelas células dos macacos tratados.

A amostragem de tecidos encontrou o produto "bandeira" do DNA em células retiradas de todos os órgãos amostrados. Este produto de excisão foi encontrado em 42% das amostras individuais de tecido de um macaco e 76% das amostras do outro. A densidade do produto de excisão variou de uma cópia por 100 a 1000 células no cérebro e amostras de cordão espiral, a 20 a 40 cópias por célula para amostras retiradas do baço e do fígado.

Os pesquisadores também procuraram por indicadores de remoção real do genoma completo. Eles ainda estão no processo de fazer isso, mas encontraram a presença de produtos de excisão indicando remoção completa do genoma em todas as amostras retiradas do baço e dos pulmões dos dois macacos, e a ausência de qualquer DNA viral do baço de um e do esquerdo pulmão de outro, indicando remoção viral completa. Eles ainda estão no processo de amostragem dos linfonodos, mas encontraram a ausência de qualquer DNA viral nos linfonodos brônquicos de um macaco e nos linfonodos inguinais do outro.

O DNA viral ainda era detectado a partir de alguns outros tecidos, mas dada a falha das células em produzir vírus, estas poderiam ser comprimentos de DNA "morto" e não produtivo. No entanto, a Dra. Tricia Burdo, apresentando, enfatizou que a prática padrão era repetir o ensaio de crescimento viral usando estimulantes imunológicos para encorajar as células remanescentes a começar a produzir vírus e isso ainda não havia sido feito.

Uma das preocupações em torno desse tipo de terapia é que ela pode danificar genes úteis, ou ativar os prejudiciais, que estão localizados perto do local de inserção do DNA viral - os chamados efeitos “fora do alvo”. Até agora não há evidências de tais alterações genéticas acidentais.

Em uma coletiva de imprensa, perguntaram a Burdo se os dois macacos poderiam ser considerados curados. Ela respondeu que seria necessário um outro experimento tratando vários macacos com a terapia com gRNA / Cas9 e, em seguida, verificando se o SIV reapareceu após terem sido retirados do TAR antes que eles pudessem começar a falar sobre uma cura. Mas o fato de que a cura estava sendo discutida no contexto de uma terapia altamente experimental que era há três anos de eficácia discutível é um sinal de quão longe chegamos.

http://www.aidsmap.com/page/3464558/